Preliminares

Prólogo de la primera edición.

T.,a presente obrita de Histología y técnica es un resumen, con aquellas reformas exigidas por los progresos de la ciencia, de nuestro Manual de Histología normal. Hemos creído que un compendio en el cual, dejando á un lado discusiones embarazosas é hipótesis mudables, se presenten condensados tanto los principios de la técnica micrográfica, como los hechos demostrados de estructura de células y tejidos, podría prestar á médicos y alumnos positivos beneficios : á éstos sirviéndoles de guía en los exámenes y trabajos de laboratorio; á aquéllos, cuyas ocupaciones clínicas les hacen recelar de toda obra algo difusa ajena á la patología práctica, recordándoles los datos indispensables para la más fácil interpretación de los fenómenos de fisiología normal y patológica.

En las descripciones de células y tejidos hemos procurado conciliar la concisión con la claridad expositiva, sin renunciar al propósito, que todo escritor naturalista debe tener, de reflejar lo más exactamente posible la fase actual de la ciencia. Sólo hemos descartado aquellos trabajos modernos no sancionados todavía por la experiencia, ó aquellas inducciones y teorías que, por su carácter filosófico, entran más bien en la esfera de la Biología general.

De todos los tejidos, el nervioso es el que hemos tratado con más latitud, lo que se justifica por la gran impul-

PRÓLOGO DE LA PRIMERA EDICIÓN

sión que su conocimiento ha recibido en estos últimos lustros, y por la importancia fisiológica de los recientes progresos. Fieles á nuestro sistema, sólo hemos puesto los descubrimientos ajenos ó propios que, habiendo sido confirmados por las autoridades más considerables en Neurología, pueden considerarse como adquisiciones definitivas de la ciencia.

Convencidos de que las descripciones de objetos macroscópicos ó microscópicos no pueden ser claras sin ir acompañadas del objeto mismo ó de su imagen, hemos intercalado en el texto un gran número de grabados, copiados, en su mayor parte, de nuestras preparaciones originales.

Madrid 10 de Junio de 1895.

Fróio|o de la sexta edición.

A ruego de algunos compañeros, deseosos de un libro de Histología algo más extenso que la primera edición de esta obra, hemos introducido en la actual aumentos y mejoras de importancia. Los capítulos más ampliados son los correspondientes á la estructura celular, la mitosis, conjugación de las células sexuales, la textura de las neuronas, de las células musculares y del tejido glandular, etc., etc. Con relación á la quinta edición, las nuevas figuras pasan de 90 y las páginas adicionadas exceden de 100.

Hemos procurado también dar una idea, siquiera sea somera, de los trabajos de aventajados histólogos españoles, á fin de rendirles merecido tributo de admiración y estima, y promover, de pasada, la afición á la investigación biológica en nuestro país.

Atentos, sin embargo, á conservar á la obra el carácter de libro elemental, casi todas las adiciones figuran en el texto con caracteres menudos (salvo las descripciones de hechos nuevos de verdadera importancia ) ; por tanto, quien aspire, no á una información detallada del estado actual de la ciencia, sino á prepararse para los exámenes, se atendrá al texto de letra gruesa, que ha sido poco modificado.

Esperamos que con las citadas mejoras, la edición actual no será indigna del favor dispensado á las anteriores.

Madrid 30 de Agosto de 1914.

'Áísry

TÉCNICA GENERAL.

CAPÍTULO I

TÉCNICA GENERAL Y SU DIVISION

Instrumentos de observación. — Microscopio simple.

Los recursos prácticos utilizados por el histólogo para la demostración de las partes elementales del organismo, forman la materia de la técnica histológica.

En la técnica general es preciso distinguir las siguientes partes; 1.*, instrumentos de observación y sus accesorios; 2/, reactivos; 3.®^, métodos histológicos, y 4."', procedimientos de conservación.

A. — Instrumentos de obseruación. — Microscopio.

El microscopio es un instrumento óptico que, interpuesto entre el ojo y un objeto próximo, nos hace percibir en éste detalles imposibles de observar á simple vista. Alcánzase este resultado aprovechando la propiedad que poseen las lentes convergentes de producir, en determinadas condiciones, imágenes reales ó virtuales amplificadas.

Si el instrumento amplificante consta de una sola lente ó sistema de lentes, se denomina microscopio simple ; pero si en él se combinan los poderes amplificantes de dos lentes ó sistemas de lentes, toma la designación de microscopio compuesto .

R. Cxjxi.. — Elementos de Histología. 1

MICROSCOPIO SIMPLE

Para mayor claridad expositiva, distinguiremos en el microscopio simple: l.°, el instrumento teórico despojado de todo accesorio; 2°, el instrumento práctico, es decir, el microscopio simple adicionado de los detalles y disposiciones exigidas por la facilidad y eficacia de la observación.

Microscopio simple esquemático. — Está representado por una lente biconvexa ó plano-convexa, dispuesta de tal suerte, que

Fig. 1. — Formación de las imágenes en el microscopio simple.

suministra una imagen virtual derecha y más grande que el objeto (1).

Para comprender el mecanismo de esta amplificación, es preciso recordar que las lentes conVe'rgentes dan, según las condiciones en que se emplean, dos especies de imágenes amplificadas: virtuales y derechas cuando el objeto examinado se sitúa entre la lente y el foco principal de ésta: reales é invertidas,

(1) El alumno debe tener presentes, al estudiar lo que sigue, los principios generales de la óptica, y especialmente las propiedades de las lentes y espejos. Aquí recordaremos tan sólo aquellas nociones de inmediata aplicación á la teoría y práctica del microscopio.

MICROSCOPIO SIMPLE

cuando el objeto se coloca más allá del foco principal. Si el objeto coincide con el foco, los rayos emergen paralelos de la lente y no hay imagen.

En el microscopio simple, el objeto yace entre la lente y su foco principal. Como puede verse en la figura 1, los rayos inci. dentes r r, partidos de las extremidades del objeto a b, atraviesan desde luego la lente, aproximándose el eje principal ; después se inclinan todavía más en tal sentido, y alcanzan el ojo del observador, quien, en virtud del principio de la proyección ó exteriorización de las impresiones retinianas en la última dirección seguida por los rayos luminosos, percibe una imagen virtual colocada en B A, es decir, á la distancia de la visión distinta. ’ ’

La construcción teórica de la imagen se logra fácilmente, trazando primeramente el eje principal y luego los ejes secundarios e e {\) que enlazan los extremos del objeto con el centro de la lente; á seguida, se dibujan los rayos incidentes r r, que, prolongados á través de la lente, donde se desvían según los principios de la refracción, penetran en el ojo del observador. La imagen virtual A B, es proyectada por la retina precisamente en el paraje donde la prolongación hacia el objeto de los ejes secundarios corta la continuación de los rayos incidentes.

La amplificación, ó sea la relación entre a 6 y A B j, se calcula fácilmente por la fórmula a = , en la cual a repre-

senta el aumento, D la distancia de la lente á la imagen virtual ó distancia de la visión distinta, y F, la longitud focal. Esta fórmula da por supuesto que el objeto está tan cerca del foco principal, que ambas distancias, la frontal y la focal, pueden reputarse idénticas. En realidad, dicha fórmula expresa el máximo de aumento de una lente utilizada como microscopio simple; si se abrevia la distancia del objeto á la lente, la amplificación disminuye y la fórmula no es aplicable, pues da valores excesivamente grandes.

(1) Recuérdese que se llaman ejes secundarios los ra3ms luminosos que, por pasar por el centro de la lente, no sufren desviación angular á la emergencia de ésta.

De la fórmula del microscopio simple se infiere que, cuanto menor sea la distancia focal, mayor será la amplificación, porque el divisor F disminuye, y D, ó la distancia de la visión distinta, permanece idéntica (1).

La distancia focal (que en las lentes biconvexas de vidrio corresponde poco más ó menos al centro de corvadura), disminuye con el radio de la lente. De dos lentes esféricas, la de mayor potencia será la más pequeña ; y como el radio puede achicarse indefinidamente, resulta que el aumento teórico del microscopio simple es indefinido. Con todo, en la práctica, rara vez puede pasarse de aumentos de 200 á 300, por la dificultad de tallar lentes suficientemente pequeñas; fuera de que esta amplificación se obtiene mucho más fácilmente con el microscopio compuesto.

Microscopio simple en la práctica (fig. 2). — El microscopio simple, dispuesto para la observación, consta substancialmente de un pie macizo de metal, que soporta una columna vertical. De un lado de ésta arranca una platina ó ménsula horizontal perforada, donde se coloca la preparación destinada al examen. En lo alto de la columna, se ve un anillo ó pinza circular que sirve para sostener las lentes ó dobletes, y este mismo anillo está unido á un prisma que se mueve en el espesor de aquélla, á favor de una cremallera. Para procurar iluminación por transparencia, el pie mantiene un espejo cóncavo ó plano, susceptible de inclinarse en todos sentidos. De los lados de la platina ó de las partes laterales del pie, según los distintos modelos, arrancan unas alas ó prolongaciones, cuyo oficio es sostener las manos durante las maniobras de preparación (fig. 2, H).

Los modelos de microscopios simples son muy numerosos. La descripción precedente se aplica, no obstante, á casi todos ellos.

En la figura 2 representamos uno de estos instrumentos construidos por Reichert.

(1) La fórmula citada es suficientemente exacta, pero si se desea mayor

precisión, debe preferirse la fórmula de Wimd: A = (~7~) O sea :

aumento (A) igual á la distancia de la visión distinta (V), menos la del ojo á la lente (e) dividida por la distancia focal y añadida de la unidad. Como la distanciado la visión distinta varía bastante (de 16 á 30 centímetros), se comprende que la amplificación sea algo diversa para cada observador.

MICROSCOPIO SIMPLE

El modelo de la fig. 34, llamado de Braus 5^ Brüner, es binocular, da la sensación del relieve y se emplea para disecar ob-

Fig. 2. — Microscopio simple de Reichert, armado de la cámara

clara de Abbe.

jetos voluminosos que no pueden montarse en la platina ni reducirse á cortes. Su especial montura permite dirigir el instru-

mentó, lo mismo sobre objetos horizontales que sobre objetos de posición vertical. Pero este aparato, como veremos más adelante, es un microscopio compuesto.

Cuando el aumento necesario para las maniobras de la disección fina no debe pasar de dos á cuatro veces, puede emplearse con provecho una simple lente montada sobre un vástago, movible en todas direcciones, á favor de una doble articulación en forma de nuez.

Inútil sería advertir que todos los microscopios simples poseen un juego de dobletes ó de lentes de diversa distancia focal, y, por consiguiente, de aumento distinto. En general, para el objeto á que se destinan, bastará con que se hallen provistos de tres

Fig. 3. — Efecto de la combinación de dos lentes en la marcha de dos rayos paralelos; el foco, que sin la segunda lente se hallaría en F, se forma eií O.

dobletes, cuyos aumentos sean de 4 á 20 ó 30 diámetros. Las ampliaciones superiores á 30 se logran mucho mejor con el microscopio compuesto.

En el estudio esquemático que acabamos de hacer del microscopio simple, hemos supuesto que cada doblete ó lente se reduce á un cristal viconvexo. En realidad no es así; cada doblete es una combinación de dos cristales plano-convexos separados por un diafragma y sujetos en una misma montura. Las caras planas se dirigen al objeto. Como demuestra la fig. 3, esta combinación en nada altera el mecanismo de formación de la imagen ; las dos lentes, colocadas á corta distancia una de otra, acortan el foco, funcionando como una sola, cuyo poder convergente fuese la suma del de las dos.

El arreglo de dos lentes, una inferior de foco largo, otra superior de foco corto, fué ideado por Wollaston, quien se propu-

MICROSCOPIO SIMPLE

SO, entre otras ventajas, la disminución de la aberración de esfericidad (que aumenta con la convexidad de la lente) y la obtención de amplificaciones relativamente grandes con lentes de distancia frontal bastante considerable. Si en la citada combinación, la lente de foco más corto se pusiera debajo, el espacio destinado á las maniobras de preparación se abreviaría sensiblemente, sin que, por otra parte, ganara nada el poder amplificante.

CAPÍTULO 11

MICROSCOPIO COMPUKSTO

Teoría del objetivo y del ocular. Doctrina de la visión microscópica según Abbe. Microscopio compuesto en la práctica.

El microscopio compuesto consiste esencialmente en un tubo provisto en sus extremos de dos lentes de aumento : la superior, que por aproximarse al ojo del observador se llama ocular, y la inferior, que por dirigirse al objeto toma el nombre de objetivo-

MICROSCOPIO COMPUESTO TEÓRICO

Opticamente, el microscopio compuesto funciona combinando los dos casos ó condiciones en que las lentes dan imágenes amplificadas : el objetivo opera como una máquina fotográfica ó á la manera de un aparato de proyección, es decir, que por residir el objeto más allá del foco principal, proyecta una imágen real, invertida y amplificada; y el ocular actúa como un microscopio simple, ó sea formando, de la imagen proyectada por el objetivo, una copia virtual todavía más grande, derecha con relación á aquélla, pero invertida con relación al objeto. Para que el ocular pueda funcionar como microscopio simple, es preciso que reciba la imagen de proyección entre el foco principal y la lente superior.

Conocida la teoría del ocular, pues, como acabamos de decir, no es otra que la del microscopio simple, diremos algo de la del objetivo, órgano fundamental del microscopio compuesto.

Teoría del objetivo. — Cuando el objeto está situado más allá del foco principal de una lente, pero sin llegar al doble de la distancia focal, prodúcese una imágen real invertida, y tanto más amplificada cuanto más cerca del foco principal se halla el objeto.

MICROSCOPIO COMPUESTO TEÓRICO

Si éste se aparta hasta el doble de la distancia focal, la imagen será de tamaño natural.

Para construir la imagen (fig. 4), se trazan, como en la figura 1, el eje principal y los ejes secundarios e e; se tiran luego dos rayos incidentes r r, los cuales, después de refractarse en la lente y aproximarse á la perpendicular, se entrecruzan, dibujando una imagen invertida y real. Esta imagen se halla justamente en el paraje en que los ejes secundarios e e, después de atravesar la lente, cortan los rayos incidentes invertidos.

La imagen se acrece en tamaño y en distancia de proyección, á medida que el objeto se aproxima al foco. Si el objeto coincide

Fig. 4. — Marcha de los rayos luminosos en el objetivo: A, B, imagen; F, foco;

e, ejes secundarios.

con el foco principal, no hay imagen, porque los rayos emergen de un modo paralelo de la superficie posterior de la lente.

El aumento se calculará con la fórmula que expresa las relaciones existentes entre el foco, la distancia del objetivo y la de la imagen.

Sea i la imagen proyectada, o el objeto, D la distancia de la imagen á la lente, d la de la lente al objeto, f la distancia focal y A el aumento. Tendremos:

Si el objeto se coloca en el doble de la distancia focal, la imagen será de tamaño natural, porque siendo d = 2 f e\ último término de la ecuación, puede reducirse á

El examen de la figura 4 y la discusión de la fórmula citada nos darán á entender claramente que :

1. ° La imagen amplificada es real é invertida.

2. ® El aumento es tanto mayor cuanto más pequeña es la distancia focal.

Fig. 5. — Esquema de la marcha de los rayos luminosos en el microscopio. — I, esquema que muestra la marcha de los rayos que atraviesan un punto enfocado de la preparación. — II, esquema de la marcha de los rayos limitantes del campo. — F*, plano focal posterior del objetivo. — F*, plano focal anterior del ocular. — F', plano focal posterior 4^1 microscopio entero (Zeiss).

3. ® Cuanto más se acerque el objeto -al foco, más grande resultará la amplificación, y á mayor distancia^ se proyectará la imagen.

4. ® LaJ imagen podrá acrecerse al infinito, cualquiera que fuere la distancia focal, con tal de prolongar ¡suficientemente la

MICROSCOPIO COMPUESTO TEÓRICO

distancia de proyección, disminuyendo progresivamente la distancia del objeto al foco.

Fig. 6. — Marcha de los rayos y formación de la imagen en el microscopio compuesto.— 0¿y., obietivo; Oc., ocular, a b, objeto microscópico; o' a', imagen real proyectada por el objetivo; A B, imagen virtual engendrada por el ocular.

5.° La amplificación podrá acrecentarse indefinidamente aun para proyecciones á corta distancia, con tal de achicar progre-

sivamente la longitud focal, ó sea el radio de la lente. En esta importante regla se funda la obtención de grandes aumentos en el microscopio compuesto.

Acción combinada de objetivo y ocular. — Después de lo expuesto, nada más fácil que comprender el mecanismo del aumento del microscopio compuesto, como puede verse en las figuras 5 y 6. Del objeto a b, proyecta el objetivo (obj.) una imagen real é invertida en a' b' , es decir, más allá del foco (F) principal del ocular (oc.). En consecuencia, esta última lente transforma la imagen real aumentada b' a en la virtual y todavía más extensa B. A. El observador percibe, pues, la imagen en B A, punto donde los ejes secundarios que pasan por el ocular cortan la prolongación de la última dirección tomada por los emergentes I p y m o, de un lado, y k o y n i, de otro (fig. 6).

Del examen de esta figura y de la consideración de las fórmulas antes expuestas, se infieren fácilmente las siguientes proposiciones :

1. *^ La imagen crece conforme disminuye el foco del objetivo.

2. ‘‘ La magnitud de la imagen con un mismo objetivo aumenta á medida que disminu3'e la distancia focal del ocular.

3. *^ La amplificación total del microscopio crece con el alejamiento del ocular al objetivo, lo que equivale á decir que, cuanto menor sea la distancia enLe el objeto y el foco principal del objetivo, más distante y más grande resultará la imagen proyectada que debe amplificar el ocular.

4. “'^ Teóricamente, todo microscopio podría dar aumentos variables al infinito, con sólo aumentar suficientemente la distancia de proyección, lo que se logra aproximando progresivamente el objeto al foco del objetivo; pero en la práctica sólo son aprovechables los aumentos obtenidos con objetivos de foco corto, por cuanto solamente éstos suministran imágenes fuertemente amplificadas á distancias relativamente cortas. Por esta razón se ha dicho, aunque incorrectamente, que el aumento está en razón inversa de la distancia focal del objetivo.

El aumento del microscopio compuesto se obtiene multiplicando el del objetivo por el del ocular, como expresa la fórmula siguiente, que comprende una de las relaciones que sirven

MICROSCOPIO COMPUESTO TEÓRICO

para calcular la amplificación del objetivo, junto con la tan conocida del microscopio simple:

F ■

Es decir, el aumento es igual :l la relación entre las distancias de la imagen al objetivo (D) y la del objeto á la lente (d), multiplicada por la relación entre la distancia de la visión distinta (D) 3^ la distancia focal del ocular (F).

Teoría de la visión microscópica según Abbe (1).— En la imagen del microscopio ha}’ que distinguir dos elementos : la imagen dióptrica ó central que da por proyección los contornos y los colores de los objetos, }’ se rige por los principios anteriormente expuestos; 3’ los espectros de difracción engendrados por los ra3ms incidentes al atravesar las finas rayas y asperezas de la preparación. Estos espectros, fundiéndose con el pincel central ó dióptrico en la imagen proyectada, revelan los finos detalles del objeto, de tal suerte que, si por circunstancias especiales, dichos rayos difractados son excluidos de la imagen, el microscopio pierde su poder resolutivo, siendo incapaz de mostrarnos las estrías 3’ otros pormenores delicados de las células y diatómeas.

Abbe ha probado que, si de preparaciones desiguales se admiten, á beneficio de diafragmas especiales, los mismos espectros de difracción, las imágenes aparecerán idénticas ; 3’ al revés, dos preparaciones que contengan rayas iguales, se mostrarán diferentes, con tal de admitir en la formación de la imagen diversos espectros.

(1) Archiv.f. mikros. Anatoni., Bd. ix, 1873. La teoría de Abbe ha sido confirmada y expuesta por Stephenson : Experiences á l’appni de la théorie du prof. Abbe sur la visión microscopique, traducido por van Heurek para su libro Le microscope, 4.“ odie., 1891. Crisp ha public.ado también un buen resumen : On the influence of Difracción in microscopique visión. Jonrn. Qiiek. mik. club., 1878. Se leerá también con provecho el estudio que á este interesante punto consaarra Czapski en el Zeitschr. fiir wissenchafliche Mikroskopie. Bd. 1891 y otras Revistas. En español poseemos no sólo

acerca de los trabajos de Abbe, sino en todo lo referente á la óptica micropráfica, el libro fundamental de Castelarnau, titulado Teoría general de la formación de la imagen en el microscopio, publicado bajo los auspicios de la Junta de ampliación de estudios. Madrid, 1911.

Los espectros de difracción de una preparación con rayas (un micrómetro, por ejemplo, ó una diatómea), pueden observarse fácilmente en el microscopio, quitando el ocular y mirando en el interior del tubo. Suponiendo que las distancias separatorias de las estrías sean iguales, veremos en el centro del tubo el pincel luminoso principal dióptrico, y á los lados y en serie perpendicular á la dirección de las estrías, varios espectros de difracción. Cuanto más próximas y finas las rayas, tanto más separados se hallan los espectros (véase la fig. 7, B).

Los interesantes experimentos de Abbe se han ejecutado utilizando como preparación un micrómetro provisto de dos series

de rayas : anchas en número de 71 por milímetro; finas en cantidad de 142 por milímetro. Examinando este retículo (fig. 7, B) sin ocular, preséntanse, en consonancia con lo expuesto, además de dos pinceles dióptricos incoloros y centrales, dos líneas de espectros de difracción ; de las cuales, la una, formada por cuatro de éstos, corresponde á las líneas finas, y la otra, constituida por un número doble, proviene de las ra3'as anchas. Examinando el preparado con el ocular, descúbrense claramente las estrías (fig. 7, A).

Esta primera observación atestigua ya que los espectros de difracción originados por raj’as finas, puesto que se desvían mucho más del pincel central que los producidos por rayas anchas, exigen, si han de ser recogidos 3" aprovechados, objetivos de gran ángulo de abertura. Compréndese bien por qué los objetivos de poca abertura, cualquiera que sea su poder amplificante, son incapaces de mostrar las estrías 3^ detalles demasiado próximos.

Los experimentos siguientes son altamente demostrativos de la doctrina de Abbe:

Primer experimento (fig. 8). — Colócase en la platina el retículo mencionado, y encima del objetivo un diafragma lineal.

A B

Fig. 7. — A, micrómetro objetivo con dos series de rayas; B, espectros de difracción que aparecen al exami-r nar dicho micrómetro con un objetivo y sin ocular.

con el que se logra eliminar los espectros de difracción, dejando exclusivamente el pincel dióptrico. En estas condiciones, examinando con ocular, no hay imagen de rayos ; el campo aparece uniformemente iluminado como si no hubiese preparación.

Segundo experimento. — Situando en el mismo paraje un diafragma de tres rendijas (fig. 9), de tal modo que sean admitidos á formar la imagen los mismos rayos de difracción de ambos retículos, el examen con ocular nos mostrará iguales las dos series de rayas, habiéndose duplicado las del retículo claro ó superior.

Figura 8.

Figura 9.

Tercer experimento. — Si, á favor de otro diafragma (fig. 10) se excluyen los rayos de difracción más próximos al centro de ambos retículos, admitiendo exclusivamente los espectros más laterales, las rayas anchas quedan cuadruplicadas y duplicadas las estrechas.

Figura 10. Figura 11.

Cuarto expei'imento. — 'í^leáiante un diafragma cuadrilongo, se prescinde de los espectros de difracción del retículo estrecho, se admiten los del ancho, y se conservan los pinceles centrales. El resultado será la desaparición de las rayas finas, y la permanencia de las anchas (fig. 11).

En suma: los experimentos clá.sicos de Abbe patentizan: 1." que las imágenes de finas rayas y detalles minúsculos no se de-

ben al pincel luminoso de proyección ó central, sino á los espectros originados en dichas estrías, mediante interferencias de los rayos incidentes que las atraviesan; 2°, dado que, cuanto más apretadas están las rayas, más se desvían sus espectros del pincel central, no queda más remedio para lograr la colaboración de éstos en la imagen que el empleo de objetivos de grande abertura numérica; 3.°, que iguales objetos dan imágenes desiguales admitiendo diferentes espectros de difracción, y, al revés, que objetos distintos producen imágenes iguales, si son aceptados los mismos espectros; 4.°, que la imagen dióptrica dibujada por proyección de cada punto del objeto, forma solamente el fondo luminoso, el color y el contorno de las partes relativamente gruesas de la preparación; los detalles delicados de ésta, y particularmente las estrías y granulaciones, se deben á los espectros de difracción.

El modelo de microscopio, construido por la mayor parte de los fabricantes con destino á los trabajos serios de histología, encierra una porción de disposiciones y mejoras que vamos brevemente á reseñar. Conviene, desde luego, que distingamos en el microscopio compuesto la parte mecánica y la parte óptica.

Parte mecánica. — Comprende el pie, la columna, la platina, la pinza y el tubo principal (fig. 12 y siguientes).

El pie es el bloque de metal que sirve de sustentáculo al aparato; su forma suele ser de herradura con la abertura hacia adelante; su peso y solidez son notables, á fin de dar estabilidad al conjunto y consentir, sin pérdida del equilibrio, la inclinación horizontal del tubo.

La columna es, ora simple, ora doble, y en los modelos regulares puede doblarse en ángulo recto, á beneficio de una charnela. Por abajo, fíjase la columna en la porción posterior del pie, y por arriba soporta el tubo del tornillo micrométrico y la platina.

La platina es una ménsula horizontal de vidrio ó de metal, donde, á beneficio de unas pinzas, se fijan las preparaciones microscópicas. En el centro existe una perforación donde asoma

Fig. 12, — Microscopio compuesto, de Reichert ; modelo de lujo con cremallera para el descenso rápido del tubo ; aparato iluminador Abbe, platina giratoria, diafragma iris, revólver porta-objetivo, etc.

el concentrador de la luz ó el diafragma cilindrico, y sirve para dar paso á los rayos emanados del espejo. En los modelos de lujo, la platina suele ser giratoria y aun movible en dos sentidos perpendiculares, lo que permite un recorrido casi automático de la preparación (figs. 22 y 25). ^

La columna es un cilindro que arranca de la parte posterior de la platina y soporta la pinza ó tubo corto provisto de hendiduras donde se desliza el tubo principal del microscopio. En dicha columna se hallan los mecanismos que permiten el descenso rápido ó lento del tubo y, por consiguiente, el del objetivo. El movimiento rápido se verifica, en los modelos económicos, por simple deslizamiento del tubo en su pinza (fig. 24); pero, en los más cómodos, se realiza á beneficio de un piñón y cremallera (figs. 12 y 18). El movimiento lento, indispensable al minucioso enfocamiento de las preparaciones, se efectúa haciendo girar el botón que corona la columna, y el cual actúa sobre un tornillo micrométrico (fig. 12). En los modelos más modernos, este tambor ó botón reside lateralmente (fig. 22).

El tubo, órgano muy principal del microscopio, es de latón ennegrecido interiormente, y consta de dos cilindros enchufados, de los cuales el interior puede sacarse para alargar la extensión total del tubo. En el extremo superior entra, por simple deslizamiento, el ocular; en el inferior se monta, mediante rosca, el objetivo.

Parte óptica del microscopio compuesto. — La forman el espejo, los diafragmas, el aparato concentrador de la luz, el objetivo y el ocular.

Espejo. — Es generalmente doble, poseyendo en una cara un vidrio azogado plano, y en la otra otro cóncavo. Por virtud de su modo de articulación á la columna, el espejo puede moverse en todas direcciones, lo que permite iluminar la preparación ya directa, ya oblicuamente (fig. 12).

Diafragmas. — Hace algunos años, casi todos los modelos de microscopio ofrecían debajo de la platina y en su centro un tubo movible, donde se colocaban los diafragmas destinados á reglar la intensidad de la iluminación. La forma de los diafragmas solía ser cilindrica, terminando en un disco taladrado (fig. 14).

En otros modelos, los diafragmas estaban representados por un disco giratorio horizontal, con agujeros de diverso diámetro, correspondientes al centro de la platina.

Actualmente, los diafragmas forman parte del aparato iluminador, haciéndose uso preferente del llamado diafragma iris,

órgano que, merced al juego de una manecilla, permite angostar á voluntad el pincel luminoso destinado á la preparación (fig. 13).

Aparato concentrador de la lus (figs. 15 y 16). — En las observaciones á grandes aumentos, no suele bastar la luz suministrada por el espejo cóncavo, siendo indispensable la aplicación de sistemas de lentes que concentren poderosamente los rayos emanados del foco luminoso.

Entre los concentradores conocidos, el más usado actualmente es el del profesor Abbe (fig. 16). Consiste este aparato substancialmente en dos ó tres lentes de gran abertura sujetas en una misma montura, y las que, á la manera de un objetivo fotográfico de foco muy corto, proyectan en el centro de la platina, y precisamente en el espesor de la preparación, una

Fig. 14. —Diafragma cilindro propio de los pequeños modelos.

imagen real muy brillante de la luz, usada para la iluminación (la llama de una lámpara, por ejemplo). Con diafragmas moderadamente anchos, la claridad es tan grande, que permite trabajar cómodamente, aun con los objetivos de foco más corto

y de mayor potencia amplificante. Por debajo de las lentes, dicho concentrador lleva un anillo giratorio donde se instala el diafragma del tipo iris (fig. 13) ; un piñón y una cremallera permiten ladear

Fig. 15. — Condensador luminoso or- cste diafragma, á fin de ob-

dinario peculiar de los medianos tener la iluminación oblicua.

modelos de microscopio.

Finalmente, en la parte inferior del aparato hay una prolongación prismática, donde va fijo el espejo refiector.

Pueden sacarse del concentrador Abbe efectos de iluminación muy varios y todos muy útiles en el estudio de las preparaciones. Así, por ejemplo: operando sin diafragma, la preparación aparece tan difusamente iluminada, que no revela sino las partes coloreadas (la cromatina de los núcleos, los microbios teñidos con anilinas, etc.) ; pero si la preparación se examina con angosta abertura, no sólo mengua la luz, sino que se perciben rigurosamente los contornos de las partes poco ó nada teñidas, ó cuyo índice de refracción apenas discrepa del medio conservador (contornos celulares, ra)^as de diatómeas, dobles dontornos de tubitos, pestañas vibrátiles, etc. ) .

El concentrador de Abbe, ordinariamente usado, carece de la corrección cromática ; pero existe un modelo, indispensable en microfotografía , perfectamente acromatizado. Los constructo-

res ingleses Powel y Lealand, venden también excelentes concentradores aci'omáticos.

La abertura del concentrador ordinario permite usar los objetivos apocromáticos fuertes (1 ‘30 y 1‘40 de Zeiss); no obstante, el objetivo l'óS de Zeiss, exige un concentrador especial, cuya abertura guarda correspondencia con la poderosa del objetivo.

Fig. 17.— Condensador parabólico de Zeiss. Marcha de los rayos luminosos en la iluminación de fondo obscuro. — B, disco opaco; P, condensador; I, capa de aire que debe descartarse mediante el aceite de cedro; O, portaobjetos con su laminilla.

Para los pequeños modelos de microscopio, la casa Zeiss construye también un concentrador más sencillo y de menor ángulo, provisto de diafragma iris, que se monta en lugar del diafragma cilindrico.

Concentradores de Ins para fondo obscuro. — En estos últimos años se han imaginado, para la percepción de microbios vivos y de particularidades estructurales en las células no fijadas ni teñidas, ciertos aparatos concentradores dispuestos de tal suerte, que el poderoso haz luminoso recolectado por el espejo, después de cruzar las lentes del aparato y de iluminar la preparación, sufra en la superficie de ésta (cara superior del cubreobjetos) una reflexión total; de esta suerte, los rayos incidentes

retornan al espejo, y los objetos heridos por ellos destacan como puntos blancos sobre fondo negro.

Se conocen hoy varios concentradores de esta especie, construidos por Richert, Leitz, etc. Uno de los mejores es el fabricado por Zeiss é imaginado por Siedentopf , y que consiste en un

Fig. 18. — Modelo V. A. de Zeiss con re- Fig. 19. — Modelo mediano de vólver porta-objetivo y un ojal en el microscopio compuesto, con pie para cogerlo. cremallera, revólver porta-

objetivo y condensador eco- ^ nómico (Stativ. VI a).

paraboloide macizo de cristal, con el cual se reemplazan las len tes del concentrador ordinario (fig. 17). La curva supero-lateral del paraboloide está calculada de tal suerte, que todos los rayos incidentes sufren en ella la reflexión total, convergiendo en el preparado, en cuya cara superior retroceden (al llegar al aire) en virtud de otra reflexión total, no sin haber iluminado el objeto, que se hace perceptible merced á los rayos de luz difusa

Fig. 20. — Modelo de microscopio llamado del estudiante

que emite. Naturalmente, el examen de la preparación se efectúa solamente con objetivos á seco. Anejo á estos aparatos va, por lo común, una lámpara eléctrica especial de gran potencia.

Merced á los concentradores de fondo negro, se hacen perceptibles las figuras kariokinéticas de las células vivas, diversas granulaciones difíciles de percibir en los preparados comunes, y,

en fin, microbios inaccesibles á nuestra retina con los concentradores ordinarios.

Objetivos.— Son los objetivos los órganos más importantes del microscopio; la bondad de éste depende enteramente de la buena construcción de aquéllos.

En los modelos económicos, el objetivo se monta atornillado al cabo inferior del tubo del microscopio ; pero es más cómodo montarlo en el revólver porta- objetivo (fig. 21), pieza que mediante un movimiento giratorio, permite utilizar sucesivamente varios objetivos de diversa

Fig. 21. - Modelo de lujo con tornillo amplificación (fig. 23). micrométnco lateral, platina giratoria ^ v » /

y revólver porta-objetivo. Antiguamente consta-

ban los objetivos de una sola lente, cuya distancia focal variaba según los aumentos que se querían obtener. Pero desde Carlos Chevalier (1833), los objetivos se construyen de varias lentes, con la doble mira de corregir la aberración cromática y de aumentar la distancia frontal ; alcánzase así también la ventaja de hacer más fácil la construcción del objetivo, pues se reparte en varias lentes de foco

relativamente l^rgo, y, por tanto, fáciles de tallar, la corvadura exagerada de la lente única de foco cortísimo,

( En los objetivos que hoy se usan, las diversas lentes constitu- 3-en un sistema inseparable, mantenido en una montura de latón

Fig. 22. — Otro modelo semejante al de la figura 21, pero provisto de platina graduada con movimientos en dos direcciones.

de forma cónica, atornillable en el cabo inferior del tubo del microscopio. Cada objetivo contiene ordinariamente tres lentes: la inf erior ó frontal de foco muy corto ; la media de foco más largo, y la superior todavía menos convergente. Casi siempre

la lente media está acromatizada y la inferior se corrige con la superior, pues en ésta domina el flint (materia muy dispersiva) y en aquélla el erovún (cristal poco dispersivo). Esta combinación de tres lentes no reza con los objetivos de gran potencia, ni con los más débiles, pues aquéllos constan de cuatro lentes (fig. 28) y éstos de una sola.

Variedades de objetivos. — Atendiendo á las condiciones de su empleo y al mecanismo de su construcción, los objetivos se clasifican en: l.°, objetivos á seco ú ordinarios; 2.°, objetivos de corrección; 3.°*, objetivos de inmersión, y 4.°, objetivos apocromáticos.

Fig. 23. — Tipos de revólver porta- objetivos.

Objetivos ordinarios óá seco. — Son los que, cuando funcionan, tienen la lente inferior ó frontal separada de la preparación por una capa de aire.

Para aumentos medianos son tales objetivos excelentes. Los hay de varios números, según su distancia focal y poder amplificante. Distínguense entre sí, ya por letras (Zeiss), ya por números (Nachet, Verick). Actualmente, va adquiriendo boga una nomenclatura más racional, porque está fundada en la distancia i focal y abertura numérica. Así Zeiss, designa uno de sus apocromáticos: 1‘30, 2 milímetros, lo que quiere decir que el objetivo en cuestión posee 1‘30 de abertura numérica y 2 milímetros de distancia focal ; indicaciones que permiten juzgar del poder resolutivo y del aumento.

Objetivos de corrección. — Amici y Ross, independientemente uno de otro, descubrieron que la imagen suministrada por los objetivos á seco es buena solamente cuando la preparación está

cubierta por una laminilla de cierto espesor; en cuanto este espesor varía, las imágenes aparecen más ó menos confusas...

Semejante defecto dimana, como puede verse en la figura 29, de que los rayos incidentes más oblicuos (A a) de un objeto O, situado en el espesor de un preparado, se desvían mucho más á su llegada al aire, que aquellos cuya dirección es menos inclinada (e E). La desviación de los r'ayos oblicuos es tanto mayor, cuanto más espeso es el cubre -objeto.

El ojo del observador, viendo el objeto en la prolongación de los rayos emergentes, no lo referirá á un solo plano, sino á varios, perturbándose al superponerse las diferentes imágenes del punto examinado.

Se evita este defecto de dos modos: ó usando solamente cubre -objetos para cuyo espesor esté corregido el objetivo, ó utilizando ciertos objetivos llamados de corrección , en los cuales las lentes superiores pueden, á beneficio de un anillo y una tuerca, separarse en más ó menos cantidad de la lente frontal. Cuanto^ más espeso es

el cubre -objeto, más deben aproximarse á la frontal las lentes superiores; de este modo los rayos periféricos, que son los más

Fig-. 24. — Modelo llamado de estudiante, construido por Reichert.

desviados, se refractarán más que los otros y la imagen de todos se dibujará en un mismo punto.

Objetivos de inmersión. — Así se designan los objetivos entre cu}^ lente frontal y la preparación se interpone un líquido, que en los objetivos de inmersión ordinarios, es el agua destilada, pero que en los llamados de inmersión homogénea, es una subs-

Der Tlsch iet centrlrt, wcau der NodÍub 1 anf 12. 4 n „ 15. 0

Cari Zeiss opt. Werkstistte Jonn.

Fig. 25. — Gran platina movible. El movimiento de la preparación en dos sentidos perpendiculares se logra á favor de cremalleras. Dos nonius, uno lateral y otro anterior, miden el desplazamiento del preparado y pueden servir para encontrar el punto interesante de éste, cuando después de un primer examen, se toma nota de la posición del porta objetos.

tancia de índice de refracción análogo al del crown (TblS), ó sea el aceite de cedro, más ó menos espesado por evaporación.

Como ya demostró Amici hace muchos años, los objetivos de inmersión son, á igualdad de aumento, mucho más luminosos que los ordinarios, porque el líquido interpuesto modera la desviación que los rayos periféricos ó más oblicuos experimentan al emerger de la preparación, permitiendo que sean recogidos por la lente frontal. Poseen además estos objetjvos una distan-

da frontal mayor que los objetivos á seco, lo que permite enfocar con mayor latitud y desahogo.

Las figuras 30 y 31 muestran claramente las ventajas de la inmersión. Los rayos incidentes (fig. 30), llegados del punto a de la preparación, al abordar la capa de aire se desvían tan fuertemente, que no pueden ser recogidos por el objetivo; los que alcancen el aire bajo un ángulo superior al ángulo límite del cristal al aire, sufrirán la reflexión total; mas si se interpone (figura 31) un líquido de igual índice que el crown, la desviación desaparece, porque la preparación, la lente frontal y el espacio separatorio, quedan convertidos en un medio casi del todo homogéneo.

Figs. 26 y 27. — Aspecto exterior de los objetivos comunes de Zeiss.

Fig. 28. — Corte vertical de un objetivo apocromático de corrección.

Objetivos apocromáticos- — Los objetivos ordinarios, ya funcionen en seco, ya á inmersión, están acromatizados solamente para dos rayos del espectro: el rojo y el azul; lo que se logra, como es sabido, combinando cristales de crovon (cristal poco dispersivo) con lentes de Jlitit (muy dispersivo).

Empero, los cálculos del profesor Abbe, de Jena, en colaboración con las casas Schott y Zeiss, le condujeron á emplear vidrios más ventajosos que los antiguos crovofi y flint para la corrección cromática de las lentes. Los objetivos construidos con estos cristales han recibido la denominación de apocromáticos; en ellos coinciden en un punto del eje tres rayos del espectro, por donde resulta casi absolutamente eliminado el

espectro llamado secundario de los objetivos comunes. La imagen es más pura y luminosa, y los colores de los objetos se muestran con gran fidelidad.

Otra ventaja consiste en que la aberración de esfericidad, que en los objetivos ordinarios se corrige para un solo color (intermedio del amarillo y verde), en los apocromáticos está corregida para dos ondulaciones distintas del espectro.

Como más adelante tendremos ocasión de notar, los objetivos apocromáticos son excelentes para la microfotografía, ya que, merced á la coincidencia focal de tres colores (rojo, verde y violado), la imagen actínica ó fotográfica corresponde al mismo plano que la luminosa.

Fig. 29.— Influencia del espesor de la lámina cubre-objetos (B) en la marcha de los rayos luminosos emanados de un punto O de la preparación.

Objetivos de gran ángulo. — Los experimentos de Abbe han puesto fuera de duda que el poder resolutivo del microscopio es función del ángulo de abertura del objetivo (véase más adelante el concepto de abertura). De aquí la necesidad de construir objetivos en donde todos los factores concurran al aprovechamiento de los rayos más desviados emergidos de la preparación, entre los cuales figuran los espectros de difracción producidos por las finas rayas y demás pormenores del objetivo examinado.

Bajo este aspecto, puede considerarse el objetivo 1‘63 de abertura numérica construido por Zeiss, con arreglo á los cálculos de Abbe, como el último esfuerzo de la óptica moderna. Es de inmersión, pero no en el aceite de cedro, sino en un líquido de índice más alto aún (1‘65), el monobromuro de naftalind. La lente frontal es de flint, cuyo índice llega á 1‘72. Su poder resol-

vente es notable y superior á todo lo que hasta hoy habíase logrado, como atestiguan los experimentos microfotográficos de van Heurck. Mas, desgraciadamente (y esto limita mucho su

Fig. 30. — Marcha de los rayos luminosos emanados de un punto en los objetivos á seco : o b, lente formada del objetivo; c o, cubre-objeto.

empleo, el conveniente aprovechamiento de su total ángulo de abertura numérica, exige el empleo de un concentrador luminoso especial, cuya lente superior es de flint muy refringente, así como el uso de porta-objetos y cubre-objetos tallados en un

Fig. 31. Marcha de los rayos emanados de la preparación en un objetivo de inmersión homogénea : o b, objetivo; c o, cubre-objeto; / i, líquido de inmersión, (Tomadas de Ellenberg’er).

flint de 1‘72 de índice. Además, con él no pueden examinarse las preparaciones ordinarias, siendo preciso usar, como vehículo conservador, el mismo monobromuro de naftalina.* Por todas estas limitaciones, ‘este objetivo se utiliza hoy casi exclusivamente en el estudio de las diatómeas.

DIVERSOS TIPOS DE MICROSCOPIOS FABRICADOS PARA FINES

ESPECIALES

Aparatos de visión ultramícroscópica. — Los aparatos de observación descritos hasta aquí, son los particularmente empleados en los estudios histológicos y bacteriológicos. Pero existen otros modelos de microscopios aplicables á casos especiales. Uno de los más interesantes es el tiltr amicroscopio . Este último tiene por objeto hacer perceptibles las partículas, cuyo diámetro es tan pequeño, que no pueden dar imágenes apreciables con las lentes de mayor aumento. El principio en que se basa el ultramicroscopio, es aquel por el cual se hacen perceptibles á la vista y sobre fondo obscuro, las partículas de polvo heridas por el sol ó las estrellas del firmamento, no obstante carecer de diámetro aparente en la imagen retiniana.

Entre los varios modelos de ultramicroscopio imaginados en estos últimos años, citaremos el sencillo de Mouton, que realiza el fondo obscuro y la enérgica iluminación mediante un prisma de reflexión total ; los iluminadores parabólicos de Reichert, Zeiss, etc. (fig. 17), fundados en el mismo principio, y el complicado aparato de Zsigmondy y Siedentopf, mediante el cual cabe explorar las partículas invisibles, tanto en preparados microscópicos como en tubos llenos de líquido. Puesto que tales aparatos tienen poco ó ningún uso en Histología, aplicándose especialmente á la bacteriología y á la químico-física (estudio de las substancias coloides, etc.), prescindiremos de hacer aquí su descripción detallada. Bastará consignar que todos ellos poseen un condensador óptico poderoso destinado á concentrar la luz del sol ó eléctrica sobre un punto microscópico de la preparación; un mecanismo de centraje de este pincel luminoso, y, en fin, una disposición del objetivo ó del concentrador, encaminada á producir un fondo obscuro, en el cual destaquen, mediante círculos irisados de difracción, los objetos invisibles enérgica y lateralmente iluminados.

Microscopio mineralógico. — Es un modelo provisto de platina giratoria 'y de goniómetros, al objeto de medir los ángulos de los cristales.

PARTE ÓPTICA DEL MICROSCOPIO COMPUESTO

Fig-. 32. — Modelo de microscopio rectificador de Zeiss dispuesto para la disección.

R. Cajal. — Elementos de Histología. 3

Microscopio monocular con prismas para la visión directa.— El modelo de la figura 32, construido por Zeiss, permite montar objetivos de larga distancia focal, excelentes para la disección. Merced á los prismas inversores, el movimiento de las agujas, visto al microscopio, es el natural, y las maniobras de disociación resultan fáciles.

Fig. 33. — Microscopio binocular de Greenouch.

Microscopios binoculares de disección. Microscopio de Greenouch fabricado por Zeiss. — Posee el modelo de Greenouch (fig. 33) dos objetivos paralelos que permiten examinar dos perspectivas de

la preparación. Por debajo del ocular hay unos prismas rectificadores de Porro, merced á los cuales desaparece la inversión de la imagen. Este modelo es excelente para la disección y tiene adecuada y especial aplicación en zoología (examen de infusorios, diminutos insectos, arácnidos y demás animalículos de pequeño tamaño), en bacteriología (exploración de colonias) y en embriología (examen de pequeños embriones).

IeiSS JENA

Fig-. 34. — Microscopio binocular de disección de Braus y Brüner.

Un modelo semejante es el de Braus y Brüner, ya citado más atrás, que se distingue del precedente por carecer de platina y estar montado sobre una columna, cuya altura es modificable á favor de una cremallera (fig. 34). Este modelo es también, como el microscopio simple, excelente para la disección. Una pequeña cámara fotográfica permite recoger la doble imagen y obtener copias stereoscópicas.

CAPÍTULO III

CONTINUACIÓN DE LA PARTE ÓPTICA DEL MICROSCOPIO

COMPUESTO

Propiedades de los objetivos. — Oculares.

Poder definidor dei objetivo. — Es la cualidad que tienen los objetivos bien corregidos de las aberraciones cromática 3^ de esfericidad, de traducir con limpieza y corrección el contorno de los objetos microscópicos.

Como es sabido, la aberración de esfericidad se explica por los físicos, considerando que toda lente está formada de una serie de prismas cuyas facetas poseen una inclinación tanto ma3mr cuanto más próximos se hallan á la periferia (1). Los ra3"os incidentes que atraviesen las regiones centrales de la lente (co- j I rrespondientes á un prisma de caras poco inclinadas) se desvia- ) '

•J j

rán mucho menos que los que crucen las regiones periféricas,. ■ 1 formándose, en consecuencia, y en distintos puntos del eje principal, una serie de focos del mismo objeto.

La abei'ración de esfericidad se corrige en los objetivos de dos modos : mediante diafragmas que eliminan los ra3ms marginales, ó combinando las lentes de tal suerte que la aberración de esfericidad de las unas se oponga á la de las otras.

La aberración cromática de las lentes es consecuencia de la. propiedad que tienen los prismas de descomponer la luz blanca en sus siete colores elementales (la lente es un conjunto de prismas). La desigual refrangibilidad de los rayos del espectro (los violados se inclinan más y constituyen foco delante de los amarillos y rojos) da lugar á que las imágenes reales producidas por

(1) Véase la teoría del prisma en los Tratados de óptica.

PARTE ÓPTICA DEL MICROSCOPIO COMPUESTO

las lentes aparezcan faltas de limpieza y con los contornos irisados.

La aberración cromática ó de refrangibilidad se corrige, como ya expusimos, reuniendo unajente convergente de crown-glas (silicato de potasa y cal) con otra divergente de flint-glas (silicato de plomo y potasa). El croicn y el Jliitt tienen un índice de refracción semejante, pero un poder dispersivo diferente. Se concibe, pues, que si emparejamos una lente convergente del cristal poco dispersivo (cro'iSúu) con otra divergente (pero menos divergente que la otra convergente) del cristal muy dispersivo (flint), la luz, descompuesta al pasar por la primera lente, se recompondrá en la segunda, sin que desaparezca del todo la convergencia.

Todo objetivo debe estar corregido, por lo menos, para dos rayos del espectro (rojo y verde claro); -en los apocromáticos la coincidencia focal se extiende á tres colores.

Poder penetrante. — El poder de penetración ó profundidad focal es la propiedad que ciertos objetivos poseen de presentar perfectamente detallados, en una misma posición del enfoque, varios planos del espesor de una preparación.

La fuerza de penetración de un objetivo está en razón inversa de la abertura numérica, como ha demostrado Abbe, quien ha

establecido la fórmula — , es decir, que la unidad de penetración se divide por la abertura numérica (a). Así, cuando menos aumente y resuelva un objetivo, mayor será su profundidad focal.

Angulo de abertura. — Es uno de los factores más importantes de la construcción del objetivo, porque, como veremos luego, de la amplitud de este ángulo depende el poder de resolución.

El ángulo de abertura de un objetivo es el formado por los rayos extremos de un objeto que concurren á formar la imagen. Es preciso distinguir dos aberturas : la geométrica y la numérica.

La geométrica corresponde á la definición indicada, y puede fácilmente medirse por varios procedimientos, entre otros por el

siguiente, debido á Amici : Se comienza por quitar del microscopio el espejo, el concentrador y el ocular; se baja luego el objetivo hasta' insinuar su lente frontal en el agujero de la platina; en seguida-se'colocan en la mesa, á los lados del pie del microscopio, dos papeles ó^dos objetos brillantes que se irán separando hasta que sus imágenes comiencen á desaparecer dentro del objetivo. Ahora no hay sino tomar en un papel la distancia de separación de los objetos y la altura del objetivo, y trazar un ángulo que reúna dichas tres partes ; este ángulo será la abertura geométrica. Foséenlo de modo exclusivo los objetivos á seco, y rara vez pasa de 80°.

La determinación del ángulo de abertura puede hacerse también por otros medios, tales como la tabla de Stephenson y el apertómetro de Abbe.

La aberttira numérica es un concepto introducido modernamente en la óptica por Abbe ; puede expresarse diciendo que es la capacidad que tiene un objetivo de utilizar, para la formación de la imagen, un número más ó menos considerable de los rayos luminosos que recibe.

Se recordará que, al tratar de los objetivos de inmersión, hemos dicho que en éstos entraban dos especies de rayos luminosos: los que serían recibidos del objetivo, aunque éste trabajase en seco, dada la amplitud de su ángulo de abertura, }’■ aquellos más oblicuos que ingresan en la lente frontal merced á la influencia del líquido de inmersión. Estos dos factores luminosos entran en la abertura numérica en la relación que marca la fórmula siguiente, establecida por Abbe : a — n sen u; es decir, la abertura numérica (a) es igual al índice de refracción del líquido de inmersión (n), multiplicado por la mitad del seno del ángulo de abertura (sen u).

En general, y para un sistema cualquiera, la abertura geométrica estará en razón inversa de la distancia focal; así, de dos lentes de igual superficie, pero de las que una tenga la distancia focal de 4 y la otra de 2 milímetros, esta última será la de mayor abertura geométrica.

La abertura numérica crece, á igualdad de ángulo, con el índice de refracción del líquido ; por tanto, de dos objetivos de foco

PARTE ÓPTICA DEL MICROSCOPIO COMPUESTO

idéntico, el que funcione por inmersión en el aceite de cedro poseerá mayor abertura numérica que el que trabaje en el agua.

Poder de resolver. — Es la cualidad poseída por los objetivos de presentar finas rayas, contrastes ligeros de índice de refracción y detalles delicados de estructura de los objetos microscópicos.

No es lo mismo aumentar que resolver. El aumento depende de la brevedad focal del objetivo, y se determina por la fórmula más atrás citada; pero la resolución, si bien exige como una de sus condiciones la cortedad de la distancia focal, resulta muy principalmente de la cuantía de la abertura numérica. Se concibe bien, por tanto, que los esfuerzos de los ópticos tiendan á producir objetivos en los cuales, aprovechando, ora cristales de alto índice, ya el gran poder refringente de ciertos líquidos de inmersión, la abertura numérica alcance todo el posible desarrollo. Ya dijimos más atrás que en esta vía el último paso habíalo dado Zeiss con la construcción de su objetivo de abertura numérica 1‘63, á inmersión en el monobromuro de naftalina. La aplicación de un líquido de inmersión de índice más poderoso, tal como el yoduro de metilo (1‘743) ó los medios arsenicales, podría acrecer todavía la abertura numérica y, en consecuencia, el poder resolutivo del microscopio. La fórmula siguiente debida á Abbe expresa la relación entre el poder resolvente (R), la

abertura numérica (n sen u) y la longitud de onda: R= —

El poder resolvente de un objetivo aumenta en la luz monocromática, y particularmente en la representada por las ondulaciones más breves del espectro (azul, violado, ultraviolado).

El valor del detalle rendido por un objetivo dado puede hallarse por la fórmula siguiente de Abbc, derivada de la anterior :

8= 2“, en la cual 8 expresa el detalle mínimo á resolver ó

la menor distancia visible entre dos rayas, 8; la longitud de onda, y 2 a el doble de la abertura numérica (1).

(1) Esto se entiende para la iluminación oblicua; en la iluminación central la fórmula es : 8

Así, para los rayos violados cuya longitud de onda es de

0‘^269 u

0‘48ól (j, 8 será igual á 2a ' mientras que para los rayos

j / T- s I. - • 1 . 0‘4861 ¡A

verdes (raya E), * sera igual a — ^ — •

.Se ve, pues, que S, ó el más pequeño detalle perceptible (1), será más diminuto iluminando la preparación con la luz azul ó violada, que con la amarilla ó amarillo-verdosa (luz que domina en la blanca).

A favor de la fórmula citada podemos averiguar el número de espacios ó de fracciones correspondientes al milímetro que cabría resolver con un objetivo de abertura numérica conocida y con una luz de longitud de onda determinada. Supongamos que utilizamos la luz violada (longitud de onda 0‘4(X)0 p), y el objetivo, r40 abertura numérica, y que en lugar de o, con arreglo á lo indicado, ponemos el milímetro en fracciones de diezmi-

lésimas. Tendremos 10.000, diez mil divididas por

0‘4000 (X 2'80 ’

que nos dará el número de rayas que dicho objetivo resolvería en la extensión del milímetro.

La fórmula Abbe marca la dirección de los posibles progresos en la capacidad resolvente del microscopio. Si 8, ó el detalle á

resolver es igual á está claro, como ha dicho Czapski (2),

Z y

que no hay sino dos caminos para disminuir la dimensión de 8: ó aumentar el divisor 2 a (abertura numérica) ó disminuir en lo posible el dividendo utilizando las ondas más breves del espectro (onda violada). La abertura numérica se compone de dos factores: el ángulo de abertura y el índice de refracción del líquido (a = n sen n) ; ahora bien, el ángulo de abertura ha llegado á su límite práctico en los objetivos apocromáticos poderosos, y el progreso se ha de realizar descubriendo substancias de un índice de refracción más elevado que las conocidas.

(1) Al hablar del menor detalle perceptible, se alude á una imagen retiniana de dimensiones tales que, á la distancia de la visión distinta (25 centímetros), sus contornos abarquen aproximadamente un ángulo de tres minutos é impresionen, por lo menos, dos elementos visuales ó conos sensibles.

(2) S. Csapski: Die voraussichtlichen Grenzen der Leistungsfahigkeit des Mikroskops. Zeitschr. f. wissenschajl. Mikroskopie, etc., Bd. viii, 1891.

PARTE ÓPTICA DEL MICROSCOPIO COMPUESTO

En suma, los avances en la potencia de resolución del objetivo podrán lograrse de dos modos: 1.*^, usando líquidos de inmersión de índice elevado; 2.°, trabajando con luz ultraviolada. Am-

Figf. 35. - Corte vertical del ocular. — a, ocular propiamente dicho; h, lente del campo;/, diafragma.

bas condiciones exigen que los constructores inventen objetivos ad hoc, corregidos esférica y cromáticamente para las ondulaciones más breves del espectro.

Luego veremos que, inspirándose en estos principios, Kohler ha ideado lentes monocromáticas en cuarto, que trabajan solamente con la luz ultraviolada invisible á nuestra retina, pero perceptible para la placa fotográfica.

Oculares (fig. 35). — El ocular es un tubo corto, que consta de dos lentes y un diafragma intermedio. Estas lentes son plano-

convexas, con la convexidad vuelta al objetivo. La lente más próxima al observador se llama ocular propiamente dicho, mientras que la inferior toma el nombre de lente del campo. El oficio de esta última es concentrar la luz destinada á formar la imagen real del objetivo, para que la lente superior ejerza su acción sobre todo el campo luminoso. La lente del campo no coadyuva, pues, al aumento, antes al contrario, disminuye algo al área del cono de proyección del objetivo ; actúa solamente dilatando el perímetro observable de la imagen.

El papel desempeñado por la lente del campo se demuestra examinando sin ella una preparación : nótase que la zona visible de la imagen es muy estrecha, no permitiéndonos juzgar del conjunto de ésta, sino á beneficio de movimientos de la preparación. La luminosidad misma disminuye notablemente.

La imagen real proyectada por el objetivo es recibida un poco por encima del foco de la lente superior. Se concibe fácilmente, después de lo expuesto más atrás, .que cuanto más corta sea la distancia focal de la lente superior, mayor será la amplificación. Los fabricantes construyen varios números de oculares, cuyo aumento varía desde dos á doce veces ó más.

La nomenclatura de los oculares suele ser arbitraria (números ó letras), no guardando ninguna relación con el aumento. Recientemente, Zeiss ha adoptado, para designar sus oculares de compensación, la base racional del número de veces que estas lentes multiplican la imagen engendrada por el objetivo. Así, el ocular 8, aumenta ocho veces la imagen de proyección ó del objetivo.

Oculares ortoscópicos. — El ocular ordinario, llamado también de Huyghens, no es acromático, ni necesita serlo para las observaciones comunes ; pero en los trabajos micro-fotográficos convienen á veces oculares perfectamente acromatizados, los cuales, construidos primeramente por Kelner, llevan el nombre de oculares ortoscópicos.

Octdares micrométrtcos. — Son aquellos que, además de las lentes superior é inferior, encierran un micrómetro, es decir, un disco de cristal con finas rayas. Más adelante trataremos de

su uso.

PARTE ÓPTICA DP:L MICROSCOPIO COMPUESTO

Oculares compensadores. — ConsiYMiáos según las indicaciones de Abbe al propósito de corregir ciertos defectos de los objetivos apocromáticos, constan de dos lentes próximas: una superior, plano convexa, y otra inferior, biconvexa ó plano-convexa, según la amplificación. Dichos oculares, cuyos números van del 1 al 18, sólo deben emplearse con los objetivos apocromáticos de Zeiss (fig. 36).

Oculares de proyección. — Ideados asimismo por el profesor Abbe , son unos oculares compuestos de una lente del campo débilmente convergente y de un ocular ó proyector biconvexo más pequeño y perfectamente acromático. Merced á un enchufe, la lente superior puede apartarse de la inferior.

Estos oculares están corregidos para proyectar, á distancias de 50 á 100 centímetros, imágenes reales sumamente puras, tan ■ventajosas para la demostración práctica ante una clase numerosa, como para la microfotografía. Esto no ocurre con los oculares ordinarios (de Huyghens y de compensación), cuyas imágenes sólo son correctas en proyecciones á cortísimas distancias.

Zeiss tiene á la venta una serie de oculares de proyección, cada uno de los cuales lleva por nombre el número de veces que amplía la imagen del objetivo. El tamaño de la imagen proyectada por el ocular (que actúa, no como los oculares ordinarios, sino como un nuevo objetivo fiojo, pues da una segunda imagen real de otra real), se obtendrá fácilmente dividiendo la distancia existente entre la imagen y el ocular por la longitud focal del objetivo, y multiplicando el cociente por el número del ocular. Sea, por ejemplo, 3 milímetros la distancia focal del objetivo, 600 milímetros la de proyección de la imagen, y 4 el número del

ocular, tendremos: A = x 4 = 800. Por lo demás, esta regla sólo es suficientemente exacta para los grandes aumentos^

CAPÍTULO IV

Cámaras claras. — Hicrofotografia.

A tres medios puede recurrir el micrógrafo para obtener reproducciones de las imágenes del microscopio: al dibujo directo, á la cámara clara y á la microfotografía. '

Dibujo directo. — Exige hábito de copiar del natural y gustos artísticos que no siempre concurren, desgraciadamente, en los dedicados á las ciencias naturales. El material lo forman lápices Faber de números distintos,’ colores á la acuarela y papel marquilla ó cartulina. Sólo el trazo de lápiz reproduce suavemente el vago contorno de las células y el incierto graneado de los protoplasmas. La pluma es menos fiel y muy dada á la dureza; no obstante, nos será imprescindible cuando queramos (lo que se hace diariamente en la ilustración de los libros histológicos), convertir un dibujo á mano en una fotocincografía destinada á la impresión con el texto. Eata clase de dibujos debe ejecutarse con tinta china bien negra, y con pluma fina, como la que emplean los litógrafos. Así y todo, conviene que la reproducción fotocincográfica encomendada al grabador sea de menor tamaño que el dibujo, á fin de obtener mayor finura y disimular la irregularidad de las líneas.

Si se desea obtener en el dibujo original un modelado de fino grano, semejante al de las litografías, se usará un papel especial, graneado, en el cual se trabaja con lápices grasos litográficos. Los fondos de línea paralelas ó cruzadas se lograrán fácilmente dibujando en el papel xilotipo, muy usado hace años para los grabados de las ilustraciones. Los diseños en papel xilotipo, ó en el de grano, tienen la ventaja de poderse transformar

fácilmente en bloques fotocincográficos de impresión. El micrógrafo no debe ignorar todos estos procedimientos, que le serán imprescindibles en sus publicaciones científicas.

Cuando se deseen en la reproducción del dibujo suaves medias tintas y fondos grises, se apelará al procedimiento de grabado llamado directo (proceder de Meisenbach ó de retícula) hoy extraordinariamente usado para la ilustración de los libros y revistas científicas. Con el fotograbado directo cabrá convertir en clichés, no .sólo dibujos, sino microfotografías. Los dibujos serán ejecutados al lavado con tinta china, ayudándose con el lápiz ó la pluma, según lo requiera laíndoledel objetoreproducido.

Cámaras claras.— Son aparatos cuyo objeto es la proyección virtual de la imagen sobre el papel en que se diseña, de tal suerte, que el observador perciba al mismo tiempo la preparación, el papel y el lápiz, y le sea mu}^ fácil trazar el contorno de las céjulas y marcar las dimensiones y distancias relativas.

Existen muchos modelos de cámaras claras; pero nosotros indicaremos solamente losusados más comunmente.

Cámara clara de Nacliet (fig. 37). — Trátase un paralelípedo de cristal alojado en una caja metálica que se coloca encima del ocular. La figura 37 muestra claramente la marcha de los rayos luminosos, y da idea del mecanismo. El Páyo R, procedente del papel y del lápiz situados á un lado del microscopio, aborda el paralelípedo, sufre en M una primera reflexión total, una segunda en N, y se hace, finalmente, vertical, penetrando en el ojo en la misma dirección que el rayo O emanado del microscopio. Este último rayo no experimenta ninguna desviación, gracias á que en la cara correspondiente del paralelípedo se halla pegado con bálsamo un pequeño prisma que transforma

Fig. 37. — Esquema de la cámara de Nachet. — T, tubo del microscopio; A, el paralelípedo de cristal ; R, rayo que llega del papel ; Ó, rayo emanado del microscopio.

este paraje en un cristal de superficies paralelas. El observador ve reunidos, en el interior mismo del microscopio, la preparación, el lápiz, el papel y la mano que dibuja.

Cámara de Abbe. — Consta esencialmente de dos partes: un espejo plano situado lateralmente (fig. 39, E) y un cubo de cristal montado en una armadura situada encima del ocular (A). El cubo de cristal se compone de dos prismas pegados con bál-

Fig. 38. — Cámara de Abbe inclinada para apreciar su montaje

sobre el ocular.

samo de Canadá; la cara adherente de uno de ellos está azogada, menos en el centro, donde el espejito tiene una perforación para el libre paso de los rayos luminosos llegados del microscopio.

El mecanismo aparece claramente en la figura 39. Los rayos Sj, emanados del papel y lápiz, son refiejados primeramente en el espejo plano E, y después en la diagonal azogada del cubo (c), en donde adquieren curso vertical, marchando confundidos y en igual dirección que los rayos del microscopio (o). Estos pasan sin desviación por la perforación de la capa azogada del sistema de prismas, y el observador ve en la platina las imágenes de la preparación, del lápiz y del papel.

Para graduar bien la intensidad luminosa de la imagen del papel, se colocan en el paraje por donde los rayos de éste penetran en el cubo de cristal, vidrios ahumados ó de colores obscuros (fig. 39).

Fig. 39. — Marcha de los rayos luminosos en la cámara clara de Abbe. — Sí, rayo emanado del papel; o, rayo llegado del microscopio; E, espejo; c, cubo de cristal.

Cámara de Zeiss. — Semejante en su disposición á la de Nachet, consta de dos prismas, situados de tal modo, que los ra)'^os luminosos que llegan del papel, después de sufrir una pri-

mera reflexión total en el prisma externo y otra en el interno, adquieren la misma dirección que los emanados del microscopio. La armadura del aparato posee, en el punto correspondiente al ocular, un agujero cuya mitad externa está ocupada por el pris-

ma interno, y cuya mitad interna queda libre para el tránsito directo de los rayos del microscopio, que penetran, unidos á los del papel, en la misma pupila del observador (fig. 40).

Actualmente se usa mucho un pupitre de dibujar muy cómodo, imaginado por Bernhard y construido por Zeiss. Merced á un ingenioso mecanismo, la mesita de dibujar puede alzarse é inclinarse lo que se desee (fig. 41).

Aparato de dibujar de Edinger. — Un simple aparato proyector de la imagen micrográfica permite ejecutar buenos dibu-

Fig. 41. — Mesita de dibujos de Bernhard, fabricada por Zeiss.

jos de las preparaciones microscópicas. Pero la recepción de la imagen sobre un telón vertical no es cómoda. Por esta razón, Edinger ha imaginado un aparato de proyección, mediante el cual el microscopio-, puesto verticalmente y en alto, envía la imagen sobre una mesita horizontal. Dos largos vástagos al alcance del dibujante permiten reglar el enfoque del preparado y la marcha de la lámpara de arco, indispensable para la proyección.

Microfotograffa. — La práctica microfotográfica exige el material siguiente: microscopio susceptible de inclinarse, objetivos

Fig. 42. — Pequeño modelo microfotográfico vertical de Zeiss. R. Cajai,. — Elementos de Histología. ^

apocromáticos y oculares de proyección, una cámara obscura fotográlica, un concentrador acromático, luz de gas, eléctrica ó solar (conducida ésta mediante un heliostato) y, finalmente, placas sensibles al gelatino bromuro de plata con los demás accesorios de fotografía.

Microscopio. — Puede servir todo modelo susceptible de inclinarse. Si se desea obtener pruebas microfotográlicas de corto aumento, será preciso usar un modelo especial (modelo mici'Oíotográlico de Zeiss, por ejemplo), que permita montar objetivos

de foco muy largo (75 ó más milímetros). El pie del microscopio se fija, á beneficio de una barra y un tornillo, á una mesa ó al banco especial que acompaña á los grandes aparatos microfotográficos (fig. 44). Si la pro3^ección de la imagen se verifica á corta distancia, el enfocamiento durante el examen de aquélla en el cristal esmerilado se efectúa con la mano ; pero en las proyecciones muy distantes será preciso enfocar mediante una larga palanca unida al tornillo micrométrico. Esta varilla no falta nunca en los aparatos microfotog'ráficos cid lioc ¡ su ausencia limita la microfotografía á la obtención de pruebas de corta amplificación.

Las cámaras microfotográficas construidas por los fabricantes (Zeiss, Reichert, Leist, etc.) comprenden muchos modelos, desde el lujosísimo de Zeiss hasta los pequeños del estudiante, formados por un fuelle instalado sobre una mesa y susceptible de trabajar vertical y horizontalmente (figs. 42 y 44).

Por lo cómoda y relativamente económica, es muy de recomendar la instalación imaginada por Orueta, de que damos copia en la figura 43. Encima del objetivo se instala un prisma de reflexión total, lo que permite ajustar una cámara fotográfica horizontal, y delante del espejo, sobre la mesa de trabajo, se dispone en sentido inclinado un pequeño banco óptico con la luz (lámpara de Nernst), concentrador, cuba de agua, diafragma, etc.

Objetivos y oculares— algunos lustros se trabajaba preferentemente sin ocular y con un objetivo común, cuya imagen era proyectada dentro de la cámara obscura. En algunos casos, lográbanse por este método buenas microfotografías. El éxito dependía del empleo de objetivos casualmente corregidos del defecto llamado diferencia focal. Con los objetivos bien corregidos para la observación ordinaria, los resultados eran detestables; lo que dimanaba de dos causas: l.° De que casi todos los objetivos comunes poseen diferencia focal, es decir, que en sus imágenes no coinciden en foco los rayos azules (que son químicamente los más aclínicos) con los rayos más luminosos (rojo, amarillo y verde); así es que al examinar la placa revelada, no se encuentran en ella los detalles de la imagen proy^ectada en el cristal esmerilado (el foco químico se halla delante del óptico).

2° Los objetivos comunes están corregidos para dar el máximode detalle en proyección á corta distancia, poco más ó menos al nivel del diafragma del ocular; por tanto, toda proyección á 40 ó 50 centímetros, es ópticamente mala.

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Fig. 44. — Otro modelo microfotográfico de Zeiss, dispuesto para funcionar con la lámpara eléctrica Nernst (5) y provisto de un sistema de sustentáculos de la cámara que permiten disponer ésta tanto en posición verti- ' cal como horizontal. I

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En vista de estos inconvenientes, que hacían casi imposible la fotografía [á grandes aumentos, se han construido por diversas

casas (Leistz, Seibert, Reichert, etc.), objetivos especiales destinados á la microfotografía y caracterizados por la total ausencia de diferencia focal. Pero á todos hacen ventaja los apocromáticos de Zeiss, los cuales, como ya expusimos más atrás, dan imágenes donde coinciden focalmente los rayos violados, verdes y rojos. Estos objetivos deben usarse con los oculares de proyección, lentes expresamente construidas para dar excelentes proyecciones, á largas distancias, de la imagen microscópica.

Líis y concentrador luminoso. — Si se quiere fotografiar á cortos aumentos (de 50 á 300 diámetros), nos bastará como fuente luminosa, un buen mechero de petróleo ó de gas (el de Auer, por

Fig. 45. — Concentrador acrornático de Zeiss apropiado para la microfotografia con los objetivos de inmersión homogénea.

cjemploj. La lámpara de Graetzin con mechero invertido, será igualmente muy útil Pero el empleo de objetivos de inmersión homogénea, y las proyecciones á larga distancia, exigen el uso de la luz eléctrica ú oxhídrica, y, mejor que todas, la solar. Modernamente la casa de Zeiss ha puesto á la venta diversas lámparas de filamento incandescente (lámparas Nernst, fig.43), muy cómodas y útiles cuando se emplean solamente medianos aumentos.

En todo caso, debajo de la platina del microscopio se instalará un concentrador acromático, destinado á proyectar, en el es* pesor mismo de la preparación, una imagen muy pura del foco luminoso (disco solar, llama del mechero, etc.). La luz de esta imagen es la que sirve para iluminar el preparado y dar una limpia proyección de sus detalles. Semejante requisito, ya men-

donado por Moitessier, y sobre el que insisten Koch, Van Heurdí, Zeiss, Neuhaus, Pfeiffer y Frankel, etc., es absolutamente preciso para el logro de buenos clichés de bacterias y de texturas celulares.

Con los objetivos apocromáticos y oculares de proyección, no es absolutamente precisa la luz monocromática; no obstante, algunos microfotógrafos la juzgan útil, á fin de aumentar el ‘poder de resolución del microscopio. Se obtiene esta luz, haciendo pasar los rayos luminosos, antes de su entrada en el concentrador, por una cuba vertical de vidrio, llena de una solución colorante, que puede ser el sulfato de cobre amoniacal (color azul, ó el filtro de Zettnow (14 de solución de ácido crómico, 160 de nitrato de cobre y 250 de agua) que da un color verde muy intenso. Ciertos autores, Orueta entre ellos, prefieren el espectro prismático, lo que exige una disposición especial del aparato iluminador.

Dicho se está que la luz solar, usada en exposiciones que no sean instantáneas, como son las que se obtienen con los rayos filtrados por soluciones coloreadas, debe manejarse con rm heliostato, por ejemplo, el de Plazmowski, que siendo uno de los mejores, es al mismo tiempo uno de los más económicos.

Placas fotográficas. — Convienen las más sensibles, pues permiten exposiciones relativamente cortas, aun con la luz de petróleo. Las placas Lumiére ó las de Jougla, rapidez mediana, marca azul, son excelentes á este objeto.

Hace tiempo han sido introducidas en el comercio las placas llamadas isocromáticas, fabricadas según los principios establecidos por el Dr. Vogel. Este sabio ha descubierto que si se mezcla á la película de gelatino-bromuro de plata un color de anilina soluble, la placa resulta especialmente sensible al color complementario, aunque éste sea de aquellos que, como el rojo, el amarillo y verde, no actúan sobre el bromuro de plata ordinario.

El Dr. Neuhauss, así como Pfeiffer y Frankel, recomiendan especialmente las placas sensibilizadas para el verde, mediante una solución de eritrosina; estas placas son indispensables cuando se utiliza el filtro de Zettnow. Actualmente existen en el mercado placas pancromáticas, es decir, preparadas de suerte

que son sensibles á todos los colores. También las placas autocromas de Lumiére dan resultados excelentes (1). Con ellas cabe reproducir el color natural de los cortes histológicos.

Los filtros coloreados, así como las placas pan ó isocromáticas, aprovechan especialmente cuando se trabaja con objetivos ordinarios provistos de foco químico. Se comprende que, en tales condiciones, las imágenes deben ser bastante puras, dado que están formadas de una sola especie de ondulación; por tanto, la imagen química y la óptica son una misma cosa. Dejamos dicho que empleando los objetivos apocromáticos, los citados filtros mejoran también la imagen; pero en tal caso, la principal ventaja buscada consiste en hacer destacar suficientemente del fondo los objetos coloreados de las preparaciones microscópicas. A este propósito, aconséjase siempre usar una cuba ó cristal cuyo color sea complementario del de las partes teñidas del preparado (núcleos, microbios, etc.).

Modus operandi. — Comienza por disponerse la luz, la cuba vertical con el líquido coloreado (si hubiese lugar á ello) y el concentrador Abbe, el cual se colocará de suerte que proyecte, en el mismo espesor de la preparación, una imagen correcta del foco luminoso. Póngase, á seguida, en la platina la preparación microscópica, que debe ser muy delgada y estar teñida con colores poco fotogénicos (rosa, amarillo, verde, pardo, etc.); luego se examina esta última con el objetivo microfotográfico y el ocular de proyección, á fin de elegir la zona reproducible, fijada la cual no hay más que inclinar el tubo del microscopio y enchufarlo en el agujero de la cámara obscura. A beneficio de una lente (fig. 46), se observará si en el cristal raspado se dibuja la imagen con la debida corrección; se sustituirá

(1) Quien desee conocer detalladamente la fotografía en color, puede consultar, entre otros libros modernos, el nuestro, titulado La Fotografía de los colores. Fundamentos científicos y reglas prácticas. Madrid, 1912.

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Fig. 46. — Lente para examinar la imagen en el cristal deslustrado.^

dicho cristal con el chasis portador de la placa; se expondrá desde algunos segundos á algunos minutos (en relación con la sensibilidad de las placas, potencia del foco luminoso, ángulo de abertura del objetivo, distancia de proyección, etc.), y se procederá á la revelación y fijado de la negativa.

Consúltense para la revelación, fijado, refuerzo, tirada de positivas, etc., los Tratados de fotografía corriente, tales como el de Londe, Dillaye y Burton, Neuhauss, Davaine, Namias (1).

Microfotografías con Ins ultraviolada. — Dejamos apuntado más atrás, al tratar del poder resolutivo de los objetivos, que este poder se acrecienta usando luz monocromática de onda breve (onda azul ó violada) ; pero esta luz que impresiona enérgicamente la placa fotográfica, actúa débilmente sobre nuestra retina, incapaz, por consiguiente, de percibir la imagen proyectada sobre el cristal raspado.

Al propósito de soslayar este inconveniente y de aprovechar la positiva ganancia de la capacidad resolutiva de las citadas ondas breves, responde el aparato microfotográfico de Kohler, fabricado por Zeiss. De él ha dado una buena descripción Orueta (2).

Consta este aparato, como el ordinario, de concentrador, objetivos, oculares, lámpara, etc., pero con las siguientes modificaciones esenciales:

(1) Los que deseen conocer á fondo la microfotografía, deben consultar los siguientes modernos trabajos:

Neuhauss: Lehrbuch der Mikrophotographie. Braunschweig, 1890. (El mejor Tratado que se conoce.

Pringle: Pratical photomicrographie. New-York, 1890.

Zeiss (R.): .Special-Catalog über Apparate für Mikrophotographie. Jena, 1888. (Se contienen indicaciones detalladas acerca del empleo de los aparatos Zeiss y microfotografía general).

Cari Franckel u. Richard Pfeiffer : Mikrophotograpischer Atlas der Bakterienkunde. Berlín, 1892. (Este Atlas está precedido de un excelente estudio sobre microfotografía general).

Henri van Heurck : Le microscope, &. 4.“^ edit., 1891. (Contiene un buen capítulo sobre microfotografía).

Se consultarán también con provecho las obras más antiguas de Moitessier, Stein, Gerlach, Benecke, etc., y, entre nosotros, los instructivos artículos de Orueta.

(2) D. de Orueta: La luz ultravioleta y sus aplicaciones en microscopia, etcétera. Revista de la Academia de Ciencias Risicas y Naturales de Madrid, tomo XL, núm. 10, 1913.

La luz es eléctrica y se obtiene por chispas brotadas entre dos electrodos de cadmio ó magnesio. Estas chispas son alimentadas por una botella de Leyden, á su vez cargada mediante poderosa bovina de inducción.

Como los objetivos ordinarios son casi opacos para la luz ultraviolada y poco transparentes para la violada, se usan objetivos llamados monocromáticos , de cuarzo fundido, substancia que deja pasar mu}^ bien los rayos cuya longitud de onda es de 0 275 (A. También se fabrican de cuarzo los porta y cubre-objetos, los oculares y el concentrador luminoso.

Naturalmente, los objetivos carecen de corrección cromática, 3' su corrección esférica se ha hecho para las ondas ultravioladas. A igualdad de apertura numérica, estos objetivos poseen una capacidad resolutiva doble que los ordinarios. Así, el objetivo monocromático ap. ni'im. V 25, equivale á un objetivo teórico (actualmente imposible) de 2*5. El líquido de inmersión es el agua, mezclada con cierta cantidad de glicerina.

Puesto que la luz emitida por los electrodos’ de cadmio ó de magnesio (longitud de 0*275 p) es imperceptible en el cristal raspado, se hace preciso, para enfocar, el empleo de un buscador, que consiste en una placa fluorescente que vuelve visible la imagen proyectada. El examen de esta imagen se hace con una lente.

El aparato de Kohler da microfotografías sumamente finas y ricas en detalles invisibles á la observación común. Ello depende, no sólo de la superior capacidad resolutiva, sino de que muchas substancias diáfanas á la luz blanca lo son poco ó nada á la onda violada y ultraviolada.

El aparato de Kohler ha sido usado con buen resultado por Tello (1) para la demostración de muchos detalles estructurales del núcleo y protoplasma de las células nerviosas. Las imágenes obtenidas de preparaciones frescas ó simplemente fijadas en formol, recuerdan las conseguidas por la microfotografía ordinaria en cortes previamente teñidos. Esto consiste en que ciertas partes (grumos de Nissl, nucléolo, etc.), son opacos para las longitudes de onda de 0*300 á 0*400.

(1) F. Tello: Algunas observaciones histológicas con los rayos ultravioletas. Trah. del Lab. de Invest. biol., 1911.